glutation eller GSH , är en icke -essentiell tripeptid tillverkad av cystein , glutamat och glycin . Det är en kraftfull antioxidant som skyddar cellerna och organ i kroppen från de skadliga effekterna av ROS , eller reaktiva syreradikaler , som bildas från molekylärt syre som en följd av olika metaboliska processer i kroppen . Antioxidanter, såsom glutation , neutralisera ROS och hindra dem från att interagera med och skadar DNA och protein i dina celler . Förhållandet av oxiderad och reducerad form av GSH i kroppen är indikativ för ROS relaterad oxidativ stress i dina body.Things du behöver
Syringe
fjärilsnålen
Centrifugera
Natriumheparin
Frys
sulfosalicylsyra
GSH Reaction Agent
Mikro
Ljuskälla
GSH standardlösning
Visa fler Instruktioner
1
Rita cirka 2 ml blod genom venpunktion till anticubetal venen med en 23 -gauge fjärilsnål fäst till en 5 ml spruta . Lägg provet till provrör innehållande natriumheparin och vänd försiktigt röret för att blanda .
2
Samla de röda blodkropparna genom centrifugering av provet vid 2500 varv per minut under fem minuter. Frysa och tina provet tre gånger för att bryta cellerna . Centrifugera cellysatet lösningen under 10 minuter vid 12000 rpm och 4 °, och samla upp supernatanten. Addera 3
bort proteinet från provet genom tillsats av 5 procent sulfosalicylsyra och centrifugering av provet vid 12000 varv per minut under fem minuter vid 4 grader. Förvara deproteinerades supernatanten vid -112 grader.
4
Blanda en tiol spårämne , GSH -reduktas, nikotinamid-adenin- dinukleotid -fosfat och analysbuffert i proportioner som anges med satsen tillverkaren att göra den GSH reaktionsblandningen. Beloppet för varje kemikalie beror på antalet tester du tänker utföra . Späd GSH reaktionsblandningen i 5 procent sulfosalicylsyra att få koncentrationer av 16 , 32 , 63 , 125 , 250 och 500 mikroliter.
5
Lägg 1-10 mikroliter av deproteinerades blodprovet i brunnarna av en mikroplatta . Lägg serieutspädd GSH standardlösning som finns i test kit , till varje brunn för att få den totala volymen av varje brunn till 10 mikroliter .
6
Lägg 90 mikroliter GSH reaktionsblandning som du gjort i Steg 4 till varje brunn i mikroplattan . Blanda reagenset genom skakning av plattan i 30 sekunder.
7
Mät absorbansen omedelbart genom att placera plattan under ljus med våglängder av 405 och 415 nanometer. Inkubera plattan i 30 minuter. Ta absorbansavläsningar efter var femte minut under inkubationen .
8
Späd 6 millimol av det bearbetade provet med 5 procent sulfosalicylsyra och trifluromethane sulfonat lösning . Detta tar bort all den reducerade GSH från lösningen . Lägg 1-10 micoliters av denna lösning till brunnarna i mikro och upprepa steg 5 , 6 och 7 . Detta kommer att hjälpa uppskatta mängden oxiderat GSH i provet .
9
Plotta absorbansen och prov koncentrationer på en graf för att erhålla den GSH kurvan för både reducerad och oxiderad glutation. Beräkna förhållandet mellan de båda formerna av GSH . Ökade nivåer oxidativ GSH nivåer indikerar oxidativ stress och ROS . Addera