glutation eller GSH är ett protein som finns i både växter och djur . Det fungerar för att hjälpa enzymreaktioner i avgiftning av miljöföroreningar . Dessutom underlättar det aminosyra transport inom celler och hjälper till att bibehålla protein sulfhydryl reduktionsreaktioner . GSH analysprotokoll använder GSH buffertar , standarder , substrat , enzymer och reagens . Efter den särskilda förfarandet är relevant för resultatet av analysen . Enzymatisk Recycling Metod
enzymatiska återvinningsmetod, för GSH , använder glutationreduktas att kvantifiera GSH . Detta protokoll är specifikt för plasma , vävnad eller odlade cellprover . Lägg reagenset DTNB ( 5 -5′- ditio-bis – 2 -nitrobensoesyra ) till GSH . Sulfhydrylgruppen i GSH reagerar med reagenset och ger en gul syra som kallas 5 -tio- 2 -nitrobensoesyra ( TNB ) . Lägg glutationreduktas till syran och GSH blandning att återvinna GSH och producerar mer syra . I detta förfarande , är graden av syraproduktionen i proportion till återvinnings reaktion GSH ; därför mäts absorbansen för TNB syra med användning av en spektrofotometer. Absorbansen ger en uppskattning av den verkliga mängden GSH i provet .
Lever Cell Glutathione Assay
protokoll analyserar mängden GSH i mänsklig hepatokarcinom ( levercancer ) celler. För att genomföra den här proceduren , använd den kolorimetriska metoden för GSH beslutsamhet att minska och oxidera GSH . Minska GSH med användning 5 -5′ -ditiobis ( 2 -nitrobensoesyra eller DTNB ) för att bilda
färgad produkt 2 -nitro- 5 – tiobensoesyra och oxiderat glutation ( GSSG ) . Använd glutationreduktas att minska GSSG att bilda GSH igen. För att mäta mängden av GSH i levercellerna , läsa provet vid 415 absorbans kinetiskt på en mikroplattläsare .
Cell apoptos
detta protokoll är GSH används för att upptäcka cell apoptos ( död ) genom mätning av minskningen i reducerad GSH . En minskning av koncentrationen av cellulära GSH är en indikator på celldöd. Färga provceller med icke- fluorescerande thiolite grönt. Den thiolite grön ackumuleras i cytosolen (cell plasma) och mitokondrier ( kraftpaket ) av cellen. Använd en flödescytometer på 490/520 nanometer för att visualisera mängden GSH i cellerna .
Totala koncentrationen av GSH i djur-och växt Prover
mäta koncentrationen av totala GSH i både reducerad och oxiderad form i olika djur-och växtprover. Lägg den allmänna tiol -reagens, 5 -5′- ditiobis [ 2 -nitrobensoesyra ] . Den tiolreagens reagerar med GSH att bilda 412 nm kromofor , 5 – thionitrobenzoic syra ( TNB ) och GS – TNB . Lägg glutationreduktas och Beta – nikotinamidadenindinukleotidfosfat ( NADPH ) för att minska GS – TNB . Den glutation kommer också att släppa en andra TMB molekyl och återvinna GSH . Dessutom är varje oxiderad GSH ( GSSG ) i blandningen fromed från disulfid reaktionen också reduceras till GSH . Använd en mikroplattläsare vid 405 nanometer för att läsa absorbansnivå och ange den totala koncentrationen av GSH . Addera