När bindande nukleinsyror eller proteiner , en hög bindande material kallat PVDF ( polyvinyldifluorid ) membran ger stöd för antikropparna . Genom Western blotting , är membranen staplas ihop , förberedd för antikroppen och sedan torkas . Protokoll för torkning av membranet kräver kunskap om hur membran fungerar , katodplattor , anodplattor och tillämpning av metanollösningar. Med rätt protokoll , membranet binder säkert med den specifika antikroppen och är redo för omedelbar användning eller lagring . Förbereda Membrane
Förbereda PVDF membran renar och stabiliserar membranet före överlåtelsen . Före torkning är membranet ” blockerade” att förhindra bindning av något annat än de specifika nukleinsyror såsom ospecifika antikroppar . Under denna procedur , du våt membranet genom att lägga den på en plan yta täckt av metanol . Membranet ändrar färg under denna fras , från ogenomskinlig till semitransparent . När du är klar med metanolbadet, är membranet placeras i avjoniserat vatten i blöt i ungefär två minuter . Membranet måste sedan suga igen i en metanollösning, som är mycket sur. Addera Assembly of Membranes Innan Transfer
Två av membran papper indränkt i den första metanollösning och placerades på en anod- plattan. Under denna process , måste du noga kontrollera om luftbubblor , vilket kan äventyra överföringen . Ett annat stycke filterpapper blötläggs i den andra metanollösning och placeras på toppen av stacken. En gel går sedan på toppen av membranet, med omsorg att inte fälla luftbubblor mellan gelén tillämpningen och membranet. Tre nya pappersbitarna därefter blötläggs i en katod -buffert och placerades på toppen av gelén. Om någon luft bubblande inträffar , arbetar ett provrör för att jämna ut membranen .
Transfer
I denna del av processen , du ansluter högspännings korder till en kraftkälla och tillämpa en konstant ström till gelén område på membranet under 30 minuter. Överföringstiderkommer att variera beroende på typen av antikropp. Efter 30 minuter, ta dig nätaggregatet och överföringsmembranet. Den nedre högra hörnet av membranet skärs sedan att kontrollera orientering . De första två lagren av filterpappret kastas , inklusive gelén. Banden i molekylvikt är markerade med en kulspetspenna .
Torkning
När överföringen är klar , torkar dig membranet på ett av två sätt . För snabbare torkning, är membranet blötlades i 100 procent metanol under 10 sekunder för avlägsnande av eventuellt vatten. Membranet vilar därefter på en bit pappershandduk under 15 minuter. För ett långsammare torkningsmetod är membranet placerades på pappershandduken utan tillsats av metanol . När torkad , kan membranet användas eller lagras i en torr behållare vid 4 grader Celsius för framtida bruk . Addera