TOPO -kloning är en process för kloning , som utnyttjar , i allmänhet , 3 ’ A-rester som är termodynamiskt instabila och kombinerar dem med en Taq DNA-polymeras . Dessutom processen använder en färsk polymeraskedjereaktionsprodukten ( PCR) som måste förvaras vid 4 grader Celsius. Denna form av kloning optimerar den aktiva topoisomeras I-molekyl läggs till i slutet av en linjär vektor. För att utföra TOPO kloning bör ett visst protokoll följas . Förberedelse
Några grundläggande åtgärder kan vidtas för att påskynda den övergripande TOPO kloning processen och bidra till dess framgång . Först bör rör av levande celler placeras på is för att behålla sin acceptans . Därefter bör super optimala kulturen ( SOC ) medium, bakterietillväxt berikad med näringsämnen , föras till rumstemperatur . De selektiva plattor ska sedan förvärmas till 37 grader Celsius , så de är helt redo när det blir dags att använda dem .
Kombinera ingredienser
< p> För att börja kloning process bör en kombination av 2 mikroliter av polymeraskedjereaktion ( PCR) produkt , 0,5 mikroliter saltlösning och 0,5 mikroliter av kloningsvektor kombineras i en 0,5 milliliters centrifugrör. När kombineras , kommer dessa ingredienser behöver ställas in i rumstemperatur och fick inkubera i fem till tio minuter . Därefter kommer de kombinerade ingredienser läggas till ” Top – 10 kemiskt kompetenta celler” i en 50 – mikroliters rör och placerades på is i ytterligare tio minuter . Efter detta måste cellerna värme chockad över 42 grader Celsius exakt och placeras på is under ytterligare en minut innan 180 mikroliter av SOC-medium tillsätts . Denna blandning skall sedan skakas i en horisontell riktning vid 200 rpm under ytterligare en timme vid 37 grader Celsius . Addera Sista åtgärderna
En blandning av 50 mikroliter och 100 mikroliter av varje reaktion bör ströks ut ” på LB + AMP + X – Gal -plattor och inkubera utan att skaka över natten vid 37 C.” Nästa dag de tre vita kolonier från varje reaktion ska plockas ut och placerades i 4 ml LB + AMP och lämnades att inkubera över natten vid en temperatur av 37 grader Celsius under skakning vid 200 rpm. Det sista steget är mini framställningen av plasmider och väntar på att se om processen lyckades. Addera